­

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (პჯრ) შესახებ

 

  • რა არის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (პჯრ) მეთოდი?

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (პჯრ/PCR) წარმოადგენს მეთოდს, რომლის საშუალებით ნუკლეინის მჟავის სპეციფიკური მონაკვეთის მილიონობით ასლის მიღება არის შესაძლებელი, რაც სამიზნის დეტექციის საშუალებას იძლევა თუნდაც მისი უმცირესი კონცენტრაციისას საკვლევ ნიმუშში. 

მეთოდი შემუშავდა 1983 წელს Kary Mullis-ის მიერ, რისთვისაც მან ნობელის პრემია დაიმსახურა ქიმიის დარგში. მეთოდის შემქნიდან დღემდე პჯრ ფართოდ გამოიყენება მრავალ სამედიცინო და სამეცნიერო დისციპლინაში, მათ შორის მოლეკულური დიაგნოსტიკის, მიკრობიოლოგიის, გენეტიკის, კლინიკური დიაგნოსტიკის, სასამართლო ექსპერტიზის, გარემოს დაცვითი მეცნიერებების, მემკვიდრეობითი კვლევებისას და მშობლის იდენტიფიკაციისთვის.

მეთოდის სახელი გამომდინარეობს დნმ-ის რეპლიკაციისთვის აუცილებელი კომპონენტის, ფერმენტი დნმ-პოლიმერაზას სახელწოდებიდან. აღნიშნული ფერმენტი არსებობს ბუნებაში. ყველაზე გავრცელებულ პოლიმერაზას Taq-პოლიმერაზა წარმოადგენს, რომელიც მიიღება ბაქტერიიდან Thermus aquaticus. ფერმენტის მოქმედებისთვის ოპტიმალური ტემპერატურა დაახლოებით 70oC-ია. ფერმენტი ახდენს დნმ-ის ახალი  ჯაჭვის სინთეზს დნმ-მატრიცაზე, დნმ-ის ოლიგო-ნუკლეოტიდების (პრაიმერების) გამოყენებით. პრაიმერები წარმოადგენს სინთეზურ ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობებს, რომლებიც კომპლემენტურია უშუალოდ სამიზნე დნმ-ის ბოლოებისა.

 

                                                                      

მოლეკულური ბიოლოგიის მეთოდების უახლესი მიღწევების და განვითარების ფონზე, შეიძლება ითქვას, რევოლუცია განიცადა ორგანიზმთა პათოგენური მოკროორგანიზმების, ვირუსების დეტექციისა და დახასიათების, გენეტიკური ცვლილებების კლინიკური დიაგნოსტიკის მიდგომებმა. აღნიშნულმა რევოლუციურმა ცვლილებამ გარდა ვირუსოლოგიისა, მიკოლოგიისა, და პარაზიტოლოგიისა, გავლენა იქონია სტომატოლოგიის, ჰემატოლოგიის, ონკოლოგიის, პერინატოლოგიის და მედიცინის სხვა მარავალი დარგის სადიაგნოსტიკო მიდგომების დახვეწასა და სიზუსტეზე.

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (პჯრ) უნაკლო მეთოდია პათოგენების სწრაფი დეტექციისთვის, რაც განსაკუთრებით მნიშვნელობას იძენს ისეთ ინფექციურ აგენტებთან მიმართერბაში, რომელთა იდენტიფიცირება საჭიროებს კულტივირებას ტრადიციული მიკრობიოლოგიური მიდგომით, რაც ხშირად პრობლემას წარმოადგენს, ან მოითხოვს დიდ დროს საბოლოო დიაგნოზის მისაღებად.

რეალურ დროში პჯრ-ის განვითარებამ,  თვისობრივთან ერთად რაოდენობრივი და გენოტიპირების მონაცემების გენერაციის შესაძლებლობით, აღნიშნული მეთოდი კიდევ უფრო ინფორმატიული გახადა.

 

                                                                      

 

პჯრ ფართოდ გამოიყენება კლინიკური ნიმუშების ანალიზისთვის, ისეთი ინფექციური აგენტების დეტექციისთვის, როგორიცაა HIV, ჰეპატიტები, ადამიანის პაპილომა ვირუსი, ეპშტეინ ბარის ვირუსი, მალარიის და ჯილეხის გამომწვევი პათოგენები.  პჯრ-ს განსაკუთრებული მნიშვნელობა აქვს HIV -ის ადრეული დეტექციისთვის, ვინაიდან ვირუსის დნმ-ის დეტექცია შესაძლებელია ორგანიზმის ინფიცირებისთანავე, განსხვავებით იმუნოლოგიური მეთოდებისგან, რომელთა  საშუალებით ანტისხეულების დეტექცია შესაძელებლია ინფიცირებიდან კვირების და თვეების გასვლის შემდეგ. პჯრ შესაძლოა ასევე გამოყენებულ იქნას, ვირუსული ინფექციის სიმძიმის შესაფასებლად, რასაც დიაგნოსტიკისა და პროგნოზისთვის უდიდესი მნიშვნელობა გააჩნია.

მალარიის ტრადიციული დიაგნოსტიკა ხორციელდება მალარიის პლაზმოდიუმის (Plasmodium falcipurum) დეტექციით, სისხლის მიკროსკოპიული გამოკვლევით. აღნიშნულ შემთხვევაში პჯრ-ის საშუალებით შესაძლებელია დადგინდეს არა მარტო არსებობა, არამედ განისაზღვროს მისი გენოტიპი და შეირჩეს პრეპარატი, რომლის მეშვეობითაც შესაძლებელი იქნება დაავადების ეფექტური მკურნალობა. ინფექციური აგენტის ტიპის დადგენა განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია შერეული ინფექციებისას.

სიმსივნის კლინიკურ დიაგნოსტიკაში პჯრ მეთოდი იძლევა მეტად მნიშვნელოვან ინფორმაციას პაციენტების პროგნოზისა და მათი რეზისტენტობის შესახებ თერაპიის ამა თუ იმ ტიპის მიმართ. სიმსვნეთა მრავალი ტიპი ხასიათდება წერტილოვანი მუტაციებით სხვადასხვა გენში, რომელთა იდენტიფიკაცია შესაძლებელია აღნიშნული მეთოდით. მაგალითად, ლეიკემიების განვითარების მიზეზი ძირითადად ქრომოსომული უბნების ტრანსლოკაციებია, რომლის შედეგადაც უჯრედები უკონტროლოდ იწყებენ პროლიფერაციას და ითრგუნება მათი გენეტიკურად პროგრამირებული სიკვდილი (აპოპტოზი). დაავადების დიაგნოსტირებისთვის ხშირად ტარდება ციტოგენეტიკური კვლევა ფილადელფიური ქრომოსომის გამოსაკვლევად. თუმცა აღსანიშნავია, რომ დაავადების საწყის ეტაპზე ფილადელფიურ ქრომოსომას ბევრი უჯრედი არ შეიცავს, რის გამოც მისი იდენტიფიცირება განვითარების ადრეულ სტადიაზე შეუძლებელია. ლეიკემიების გამოვლენა მათი განვითარების ადრეულ სტადიებზე შესაძლებელია პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციით.

აღსანიშნავია პჯრ მეთოდის გამოყენება გენეტიკური დაავადებების დიაგნოსტიკისთვის, როგორიცაა ცისტური ფიბროზი, თრომბოფილიები, ნამგლისებურ უჯრედოვანი ანემია, ფენიკლკეტონურია, კუნთოვანი დისტროფიები. ამავე მეთოდით შესაძლებელია ნაყოფის სქესის და მისი რეზუს (Rh) სტატუსის დადგენა ორსულობის მე-10 კვირაზე.

პჯრ მეთოდი გამოიყენება როგორც კაპილარული ელექტროფორეზის, ასევე შემდეგი თაობის სევქნირების ნიმუშების მომზადების ეტაპებზე.

პჯრ მეთოდის პრინციპი - ექსტრაქციის ეტაპი

ანალიზის განხორციელების პირველ ეტაპზე საჭიროა დნმ-ის (ან რნმ-ის) გამოყოფა ნიმუშიდან, რისთვისაც შემოთავაზებულია მზა ნაკრებები ნუკლეინის მჟავების ექსტრაქციისთვის. ექსტაქციის ეტაპი მოიცავს რამოდენიმე საფეხურს: ნიმუშში (ქსოვილი, შრატი, სისხლი, შარდი, ნაცხი და ა.შ.) არსებული ცილების ლიზისი, მათი მოცილება გამრეცხი ბუფერების საშუალებით, სუფთა ნუკლეინის მჟავების მიღება ელუციის ეტაპზე.

 

                                                  

 

 

პრე- და ამპლიფიკაციის ეტაპები

პჯრ - რეაქციის "მასტერ-მიქსის" აუცილებელი კომპონენტებია:

  • წყალი;
  • PCR ბუფერი;
  • MgCl2;
  • dNTPs;
  • პრაიმერები;
  • სამიზნე  დნმ;
  • საღებავი (SYBR green) ან ფლუორესცეტულად მონიშნული სპეციფიკური პრობები;
  • პოლიმერაზა.

პჯრ-ის ყველა კომპონენტის შერევის შემდეგ მცირე მოცულობის სინჯარაში (პლანშეტი, სტრიპი ან ტუბი), რეაქცია ხორციელდება თერმოციკლერის საშუალებით, რომელიც ახორციელებს ტემპერატურული რეჟიმის სწრაფ ცვლას.

პირველი ეტაპი ცნობილია როგორც დენატურაციის ეტაპი, რომელიც სარეაქციო არის ტემპერატურის 95oC-მდე მომატებას გულისხმობს.  დნმ-ის შემადგენელი ორი ჯაჭვი სცილდება ერთმანეთს (დენატურირდება);

მეორე ეტაპი - ანელინგი საჭიროებს 55-60oC ტემპერატურას. ანელინგის ეტაპზე დენატურირებულ დნმ-ის ჯაჭვებს კომპლემენტარულად უკავშირდება პრაიმერები.

მესამე - პოლიმერიზაციის ეტაპი ხორციელდება 72oC-ზე, რომლის დროსაც Taq პოლიმერაზა უკავშირდება მატრიცასთან დაკავშირებულ პრაიმერს და იწყებს ახალი ჯაჭვის სინთეზს სარეაქციო არეში არსებული კომპლემენტარული ნუკლეოტიდების ჩართვით. ამით მთავრდება რეპლიკაციის (დნმ-ის ჯაჭვის გაორმაგების) პროცესის ერთი ციკლი.

მომდევნო ციკლში მიქსტურა კვლავ ცხელდება 95oC-ზე, რათა კვლავ მოხდეს დნმ-ის ორჯაჭვიანი მოლეკულების დენატურაცია, პრაიმერების დაკავშირება (ანელინგი) და სინთეზი (პოლიმერიზაცია).

თითოეულ ციკლში ხდება არეში არსებული მატრიცის გაორმაგება.

SYBR green საღებავის გამოყენების შემთხვევაში არეში დნმ-ის ორმაგი ჯაჭვის არსებობისას საღებავის მოლეკულები უკავშირდება დნმ-ს და ფლუორესცენტულ სიგნალს იძლევა, რომელიც აღირიცხება რეალურ დროში. 

ფლუორესცენტულად მონიშნული პრობების შემთხვევაში მათი დაკავშირება ხდება სამიზნე მონაკვეთთან სპეციფიკურად, კომპლემენტარობის პრინციპით, რასაც ასევე ფლუორესცენტული მოლეკულის მიერ სიგნალის გამოსხივება და მისი დეტექცია მოყვება.

           

 

  • პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის ლაბორატორია მოიცავს სამ 

       დამოუკიდებელ ზონას:

  1. ნიმუშების დასამუშავებელი და ნუკლეინის მჟავების საექსტრაქციო არე;
  2. პრე-პჯრ: მასტერიმიქსის და ნიმუშების შესარევი არე;
  3. პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის ოთახი.
  • თითოეული ზონა კონტამინაციის თავიდან ასაცილებლად აღჭურვილი უნდა

        იყოს UV ნათურით.

ზონა #1

#

აღჭურვილობა:

1.

 II დონის ბიოუსაფრთხოების კაბინეტი

2.

მაგიდის მაღალსიჩქარიანი ცენტრიფუგა (მაცივრიანი)

3.

თერმობლოკი

4.

ვორტექსი

5.

ცენტრიფუგა

6.

მაცივარი, საყინულე  (x2)

7.

პიპეტების კომპლექტი: 0-10ul, 100ul,200ul, 1000ul, 5000ul (x2)

8.

მაგიდა

9.

კარადა

10.

სკამები (x3)

11.

ნარჩენების სპეც. ურნა (2)

12

რეკები 1.5 – 2.0 მლ სინჯარებისთვის (x4)

ზონა #2

#

აღჭურვილობა:

1.

 PCR - ბოქსი

2.

მინი ცენტრიფუგა-ვორტექსი

3.

ვორტექსი

4.

მაცივარი, საყინულე

5.

პიპეტების კომპლექტი: 0-10ul, 100ul,200ul, 1000ul (x2)

6.

ფლუორომეტრი

7.

წყლის პურიფიკაციის სისტემა

8.

ფლეითების ცენტრიფუგა

9.

მაგიდა

10.

კარადა

11.

სკამები (x2)

12.

ნარჩენების სპეც. ურნა (2)

13.

აპლიკატორი

14.

რეკები 1.5 – 2.0 მლ სინჯარებისთვის (x4)

15.

96 - ფოსოიანი პლანშეტის რეკები (x2)

       

 

ზონა #3

#

აღჭურვილობა

1.

RT-PCR სისტემა

2.

მაცივარი

3.

საყინულე -80°C

4.

კომპიუტერი (x2)

5.

მაგიდები (x3)

6.

სკამები (x3)